實戰經驗丨競爭性ELISA：受體蛋白包被濃度及配體蛋白-Tag飽和濃度的確定

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01 

·Tag飽和濃度的確定：

1. 包被：用1×包被液將受體蛋白稀釋若干個濃度（如2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL），每孔加入100µL包被液，4℃包被過夜（確定最佳包被濃度）；

2. 洗滌：棄去（或回收）板內液體，用PBST洗滌液（0.05%吐溫20）每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干；

3. 封閉：加入封閉液（1%BSA溶液），每孔200 µL，保鮮膜包裹酶標板，放置于37℃水浴鍋中，水浴1h；

4. 配制配體蛋白-Tag溶液：用樣品稀釋液將配體蛋白-Tag稀釋至1 µg/mL（稀釋液為0.5% BSA），3倍系列稀釋，共10個梯度（封閉結束前半小時，防止樣品變質）；

5. 加樣：每孔加入100 µL配制好的配體蛋白-Tag溶液，保鮮膜包裹后，放置于37℃水浴鍋中水浴2h；

6. 洗滌：棄去板內液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干。

7. 加酶標二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀釋液為0.5% BSA），37℃水浴鍋中水浴1.5 h；

8. 洗滌：棄去板內液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌5次，拍干；

9. 顯色：每孔加入100µl顯色液（TMB），顯色15 min；

10. 終止：每孔加入50 µL 10%硫酸終止；

11. 檢測：酶標儀檢測OD450和OD630的吸光度值。

注：最終依據擬合的濃度-吸光度曲線，確定合適的受體蛋白包被濃度，并且同時確定該包被濃度下的配體蛋白飽和濃度。

02 

1. 用先前確定的最佳的受體蛋白包被濃度包被板子，同上述條件洗滌，封閉；

2. 配置不同起始濃度的待測抗體：用樣品稀釋液將待測抗體稀釋若干個濃度（如80 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL），再將上述稀釋液進行3倍稀釋，共10個梯度（封閉結束前半小時，防止樣品變質）；

3. 在受體蛋白包被板中加入2倍飽和濃度的配體蛋白-Tag溶液，每孔50 µL，立即加入50 µL系列稀釋的待測抗體，保鮮膜包裹后，放置于37℃水浴鍋中水浴2h；

4. 洗滌：棄去板內液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干。

5. 加酶標二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀釋液為0.5% BSA），37℃水浴鍋中水浴1.5 h；

6. 洗滌：棄去板內液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌5次，拍干；

7. 顯色：每孔加入100µL顯色液（TMB），顯色15 min；

8. 終止：每孔加入50 µL 10%硫酸終止；

9. 檢測：酶標儀檢測OD450和OD630的吸光度值。

總結

ELISA實驗是實驗室十分常規的檢測手段，總體操作難度不大，但由于操作步驟繁多，且結果較為靈敏，容易出現結果差異較大的現象，因此需要格外注意上樣的順序及加樣量，以保證盡可能縮小誤差。競爭性ELISA較普通ELISA實驗額外多出一個實驗組分，需要在開展正式實驗之前盡可能多摸索幾個各個組分的工作濃度，以保證最終的結果在較好的范圍內呈現。