免疫組化的具體步驟

一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：

1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行

2. 緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。

10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鐘。

（注： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）

12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）

14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。

二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ：

（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步后進行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

（ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

（ 6 ）、滴加適量 生wu素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

（ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

（ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：

冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化